Долголетие и FOXO

Здоровое старение - это сложный процесс взаимодействия генетических факторов и факторов окружающей среды. Точный вклад генетической составляющей в долголетие варьируется от человека к человеку, но было показано, что он превышает 20% в популяциях со средней продолжительностью жизни и приближается к 50% в долгоживущих популяциях. Особенно важным вклад генетических программ в определение продолжительности жизни человека становится после 60 лет. Различные варианты (аллели) гена FOXO3 являются подтвержденными генетическими детерминантами, которые влияют на продолжительность жизни человека. Гены семейства FOXO (forkhead box O) кодируют факторы транскрипции, которые регулируют активность многих других генов, в частности, связанных с инсулин-зависимыми процессами и процессами с участием инсулиноподобного фактора роста, являющихся важными модификаторами патогенеза нейродегенеративных заболеваний (в том числе болезни Альцгеймера). Факторы транскрипции FOXO влияют на экспрессию генов, регулирующих апоптоз, клеточный цикл и устойчивость к окислительному стрессу, принимающих участие в метаболизме глюкозы, клеточной дифференциации, атрофии мышц, и даже энергетическом гомеостазе.

Интерес к роли семейства генов FOXO возник благодаря исследованиям на нематодах Caenorhabditis elegans, для которых было показано, что некоторые мутации приводят к увеличению продолжительности жизни нематод в 2-3 раза, при этом большинство мутантов сохраняли свое здоровье даже после того, как контрольные нематоды уже умерли. Увеличение продолжительности жизни зависело от гена daf-16, который оказался гомологом генов FOXO человека.

Как правило один и тот же ген существует в популяции в виде нескольких вариантов (аллелей), встречающихся с различной частотой. Очень часто эти варианты различаются тем, что в одной и той же позиции в ДНК в разных аллелях находятся разные нуклеотиды (SNP – однонуклеотидный полиморфизм). Эта вариативность в одном нуклеотиде может как совсем не влиять на работу гена, так и быть ассоциированной с определенными признаками или заболеваниями. Эти ассоциации позволяют ученым использовать SNP, чтобы оценить генетическую предрасположенность человека к развитию различных признаков или заболеваний. 

Первое исследование возможной ассоциации вариантов гена FOXO с продолжительностью жизни человека было проведено в 2008 году Виллкоксом и др., когда была впервые обнаружена связь некоторых однонуклеотидных полиморфизмов в гене FOXO3 с долголетием человека. В дальнейшем значимая связь между SNP FOXO3 и продолжительностью жизни у людей была независимо воспроизведена во многих исследованиях популяций, включая полногеномный поиск ассоциаций (GWAS). В результате исследований был обнаружен высокий уровень корреляции между присутствием в геноме человека редкого аллеля rs2802288 (А) и долголетием как для мужчин, так и для женщин. Присутствие хотя бы одной копии редкого аллеля rs2802288(A) увеличивает вероятность дожить до 100 лет в ~1.5 раза.

 

Для анализа rs2802288 нами была разработана тест система на основе ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это простой и распространенный лабораторный метод, используемый для создания множества копий определенного участка ДНК. С помощью ПЦР последовательность ДНК можно скопировать несколько миллиардов раз, создавая достаточное для анализа количество одинаковых фрагментов ДНК. ПЦР используется во многих исследовательских лабораториях, а также имеет практическое применение в судебной медицине, генетическом тестировании и диагностике. TaqMan анализ используется для детекции отдельного нуклеотида в определенном месте фрагмента ДНК, благодаря его чувствительности и специфичности. Зонд TaqMan представляет собой специально разработанную синтезированную последовательность нуклеотидов, на одном конце которой находится флуорофор, способный флуоресцировать, а на другом гаситель флуоресценции, поглощающий свечение флуорофора. В таком состоянии флуоресценции от зонда не регистрируется.

В ходе ПЦР зонд находит последовательность, для изучения которой он был разработан, и присоединяется к ней. Taq ДНК-полимераза, синтезирующая копии ДНК в ПЦР, способна расщеплять зонд, начиная с гасителя. Если последовательность нуклеотидов зонда полностью совпадает с исследуемой последовательностью ДНК человека, зонд расщепляется Taq-полимеразой, гаситель и флуорофор перестают быть связанными вместе в зонде и флуоресценция флуорофора регистрируется. Если последовательность нуклеотидов зонда не совпадает полностью с анализируемым участком ДНК, зонд не расщепляется Taq-полимеразой, а сталкивается в сторону, неповрежденный, потому флуоресценция, излучаемая флуоресцентным красителем продолжает поглощаться гасителем в рамках зонда и флуоресценции не регистрируется.

Аллельная дискриминация - это название метода, который используется для обнаружения двух небольших различий (например, SNP) внутри одного гена за счет измерения флуоресценции, полученной с использованием двух разных зондов. Для каждого исследуемого варианта аллели используется свой флуорофор, подобранный таким образом, чтобы спектры двух используемых в реакции флуорофоров не пересекались. В зависимости от детектируемой амплификатором во время ПЦР в реальном времени флуоресценции, образцы распределяются на 3 группы: в обеих хромосомах в изучаемом гене находится аллель №1 (свечение флуофора только от зонда №1) – гомозигота по аллелю №1; в обеих хромосомах в изучаемом гене находится аллель №2 (свечение флуофора только от зонда №2) - гомозиготы по аллелю 2; в одной хромосоме находится аллель №1, во второй – аллель №2 (свечение флуорофоров из обоих зондов) - гетерозигота. Это позволяет легко анализировать результаты реакции. 

Мы разработали систему аллельной дискриминации для анализа полиморфизма rs2802288, где зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю A, зонд с красителем ROX – аллелю G. На рисунке представлены результаты работы нашей системы, где видно четкое разделение образцов на кластеры, где кластер ♦ соответствует отрицательному контролю, кластер ◼ - гомозиготам GG, не имеющим генетической предрасположенности к долголетию, кластер ▲ – гетерозиготам AG, имеющим генетическую предрасположенность к долголетию человека, кластер ● – гомозиготам AA, имеющим генетическую предрасположенность к долголетию человека.  Все полученные результаты были подтверждены секвенированием, что доказывает правильность работы разработанной нами системы.

Разработанный нами метод обладает следующими преимуществами:

1. Позволяет оценить генетическую предрасположенность к долголетию,
2. Является точным, простым, быстрым и недорогим в исполнении,
3. Не требует медицинских знаний, сбора анамнеза или присутствия пациента,
4. Может быть проведен с использованием различных видов биологического материала, содержащих ДНК пациента (венозная кровь, буккальный эпителий, волосяные фолликулы и др.),
5. Может использоваться для любой группы населения,
6. Позволяет оценить вероятность передачи данного признака потомкам,
7. Результат исследования не зависит от текущего состояния здоровья пациента. 

Прогнозирование развития аллергических заболеваний

На сегодняшний день для оценки риска развития аллергических заболеваний, что очень важно для персонализированной медицины при выборе способов лечения различных болезней и назначения лекарственных препаратов, в основном используют сбор семейного анамнеза. Недостаток этого метода связан с его субъективностью. Для расширения числа доступных методов оценки риска возникновения аллергических заболеваний и повышения точности оценки риска их развития нами была разработана система комплексного анализа генетических полиморфизмов, связанных с аллергическими заболеваниями.

Фото Игоря Лапенко, коллаж Марины Мищенко | Лаборатория ДжелеповаРазработанная система также состоит из TaqMan зондов и праймеров и основана на анализе полиморфизмов rs2251746 и rs2427837 гена FCER1A, связанных с уровнем иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови человека. Основной ролью IgE является защита организма от паразитов, представлявших серьезные риски для выживания человека в дикой природе. Также была выявлена корреляция между уровнем IgE в сыворотке крови и различными аллергическими заболеваниями - при высоких уровнях сывороточного IgE возрастает вероятность развития атопического дерматита, астмы, аллергических ринита и риноконъюнктивита и т.п. Поэтому высокий уровень сывороточного IgE является маркером ряда аллергических заболеваний, а низкий сывороточный уровень IgE является одной из причин пониженной устойчивости к паразитарным заболеваниям и токсинам животного происхождения.

Ген FCER1A кодирует альфа-цепь высокоаффинного рецептора IgE, который связывается с аллергеном и запускает процесс развития воспалительных реакций и реакций гиперчувствительности немедленного типа. Различные исследования показали высокий уровень корреляции между присутствием в геноме человека rs2251746 или rs2427837 и уровнем IgE в сыворотке крови, а также вероятностью развития аллергических реакций. Использование разработанной нами системы аллельной дискриминации для этих двух полиморфизмов позволяет быстро и точно оценить генетическую предрасположенность к развитию IgE – зависимых аллергических заболеваний и дать необходимые рекомендации о лечении или параметрах образа жизни.

Все разработанные нами системы анализа позволяют не только быстро получить информацию о той или иной генетической предрасположенности, но и перейти к персонализированной медицине, учитывающей индивидуальные генетические особенности человека при постановке диагнозов и выборе схем лечения.

начальник сектора канд. биол. наук Елена Кравченко,

Анастасия Иванова,

Сектор молекулярной генетики клетки,

Лаборатория Джелепова, ОИЯИ

---

Читайте также:

Поздравляем Елену Владимировну Кравченко и Анастасию Евгеньевну Иванову с получением патента!

МОСРЕГ: Молодые учёные нашли быстрый способ узнать, кто сможет прожить 100 лет

Новости лаборатории