История молекулярно-генетических исследований Drosophila melanogaster на фазотроне
Рассмотрим эти вопросы подробнее:
- Какова природа изменений ДНК у спонтанных и индуцированных редко- и плотноионизирующим излучением (в нашем случае γ-кванты 60Со и реакторные нейтроны 0,85 МэВ) рецессивных «точковых» генных мутаций, наследуемых потомками облученных родителей?
- Какова зависимость частоты этих изменений от дозы и качества ионизирующей радиации?
- Каков спектр этих изменений у радиационных мутаций разных генов?
- Какова величина гаметической удваивающей дозы (УД) на молекулярном уровне для отдельных типов изменений ДНК;
- Каковы механизмы репарации первичных повреждений ДНК (одно- и двунитевые разрывы), индуцированных в гаметах, активны на раннем этапе эмбриогенеза после оплодотворения?
- Каков характер и масштаб радиационно-индуцированных изменений ДНК на уровне генома, наследуемых потомками облученных родителей?
Решение этих вопросов имело большое не только фундаментальное, но и прикладное значение, учитывая тот факт, что, согласно накапливающимся данным, «точковые» мутации соответствующих генов определяют почти половину наследственных генетических болезней и аномалий развития человека и в основе этих мутаций лежат те же типы изменений ДНК, которые наблюдаются в эксперименте у радиационно-индуцированных «точковых» мутаций. Методологической основой названных исследований, проводимых Группой молекулярной и радиационной генетики Отдела фазотрона ЛЯП, стал сравнительный анализ мутаций одновременно пяти разных генов (yellow, white, black, cinnabar, vestigial) с фенотипическим проявлением (желтое тело, белые глаза, черное тело, алые глаза, бескрылые особи), получаемых в пятилокусном тесте. Для комплексного молекулярного анализа спонтанных и радиационно-индуцированных мутаций этих генов были применены наиболее адекватные для этих исследований методы молекулярной биологии и генетики (блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ, ПЦР, секвенирование по Сенгеру, полное секвенирование генома (WGS)).
Рассматривая уже проведенные исследования, необходимо и важно перечислить следующие полученные фундаментальные результаты:
1) впервые подтверждено ранее общее представление (Н. В. Тимофеев-Ресовский, А. С. Серебровский) о реконструктивном (наличие внутригенных изменений), а не деструктивном (потеря гена), характере действия редкоионизирующей радиации на гены в генеративных (половых) клетках животных, поскольку среди изученных методами блот-гибридизации и ПЦР 197 «точковых» мутаций пяти изученных генов не было обнаружено ни одного случая потери всего гена, в отличии от соматических клеток, где регулярно наблюдаются потери всего гена;
2) впервые ПЦР-анализ позволил установить сложную картину внутригенных изменений, которая представлена четырьмя классами разных по масштабу изменений ДНК:
а) изменения, не выявляемые ПЦР (ПЦР+-мутанты);
б) изменения в виде отсутствия одного из фрагментов, на которые подразделён ген;
в) отсутствие нескольких смежных фрагментов;
г) отсутствие одновременно нескольких разных фрагментов (кластеры мутаций ДНК), соотношение которых зависит от дозы и качества радиации;
3) сиквенс-анализ 83 ПЦР+ мутаций, индуцированных γ-излучением и нейтронами двух разных генов, позволил установить регулярно возникающие типы изменений ДНК (замена оснований, инсерции/делеции (инделы) разной величины, события генной конверсии), соотношение которых также зависит от качества радиации и положения гена в геноме;
4) идентификация изменений ДНК, которые являются, согласно научным данным, продуктами определенных систем репарации одно- и двунитевых разрывов ДНК (NHEJ, SSA, SDSA, HR), впервые позволяет нам утверждать, что в первом митотическом цикле раннего эмбриогенеза после оплодотворения активно функционируют все четыре вышеназванные системы репарации.
Важным результатом проведенных исследований явилось открытие генной конверсии на раннем этапе эмбриогенеза как регулярно действующего механизма межаллельной рекомбинационной репарации (HR) сложных, комплексных первичных повреждений ДНК, индуцированных в гаметах родителя.
5) установление одних и тех же типов изменений ДНК и определение их частоты у спонтанных и γ-индуцированных «точковых» мутаций двух генов впервые позволило оценить генетическую опасность (риск) редкоионизирующей радиации в индукции замен оснований и инделов, которая на молекулярном уровне при определении методом УД оказалась в 5 и 2 раза соответственно выше, чем на фенотипическом уровне;
6) Предварительные результаты полногеномного секвенирования потомков от самцов, облученных γ-квантами в дозе 40 Гр показали, что частота крупных инделов в геноме (4,81Е-9/Гр/нуклеотид) практически совпадает с величиной (4,26Е-9/Гр/нуклеотид), описанной в литературе для этих же изменений у мыши, что позволяет экстраполировать эти данные на человека. Важно также отметить, что частота инделов на геном в 6 раз выше таковой для этих изменений на уровне отдельных генов (0,85Е-9/Гр/нуклеотид) у одного и того же организма-дрозофилы.
Подводя общий итог 35-летним исследованиям, важно отметить, что впервые охарактеризован спектр изменений ДНК у рецессивных генных мутаций, индуцированных редко- и плотноионизирующим излучением и наследуемых потомками облученных родителей. Частота «точковых» мутаций линейно растет с дозой, тогда как относительная частота отдельных типов изменений ДНК в их общем спектре существенно зависит от качества излучения и положения гена в геноме. Открытие генной конверсии, основанной на межаллельной гомологичной рекомбинации (HR), свидетельствует об эффективной репарации сложных, комплексных повреждений ДНК, индуцированных в гаметах облученного самца-родителя в первом митотическом цикле эмбриогенеза, когда материнский и отцовский геномы впервые объединяются. Новым и инновационным является впервые разработанный нами подход к оценке опасности (риска) ионизирующих излучений на молекулярном уровне при индукции отдельных типов изменений ДНК в пределах гена и генома в целом. Дальнейшее развитие начатых исследований с вовлечением в анализ спонтанных и радиационных мутаций трех оставшихся генов и продолжение работ по полногеномному секвенированию потомков облученных родителей, должны, несомненно, существенно расширить уже полученные представления о закономерностях и механизмах действия ионизирующих излучений на молекулярном уровне в половых клетках высших организмов. По результатам исследований опубликовано 33 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
почетный сотрудник ОИЯИ,
главный научный сотрудник ЛЯП ОИЯИ,
доктор биологических наук
Игорь Донатович Александров
